سیتیزین (همچنین به عنوان باپتیتوکسین شناخته می شود) یک آلکالوئید مهم است که از گیاهان حبوباتی مانند *Sophora alopecuroides* و *Thermopsis lanceolata* استخراج می شود. به طور گسترده در زمینه هایی از جمله داروسازی، حفاظت از گیاهان و عوامل بیولوژیکی استفاده می شود. خلوص محصول مستقیماً کارایی کاربرد و انطباق با مقررات آن را تعیین می کند. در حال حاضر، روشهای صنعتی برای آزمایش خلوص سیتیزین بر اساس سناریوهای دقیق، هزینه و کاربرد به سه نوع طبقهبندی میشوند: آزمایش سریع کیفی، آزمایش کمی معمولی، و{2}}تعیین کمی با دقت بالا. روشهای مختلف برای اشکال مختلف نمونه، مانند عصارههای خام، محصولات نهایی صنعتی و استانداردهای مرجع مناسب هستند. موارد زیر به تشریح روشهای رایج تست صنعت و نکات کلیدی می پردازد.
I. کروماتوگرافی لایه نازک (TLC): غربالگری کیفی سریع، مناسب برای آزمایش اولیه محصولات خام
TLC رایج ترین روش غربالگری سریع در طول تولید و استخراج سیتیزین است. کارکرد آن ساده و مقرون به صرفه است و در درجه اول وجود سیتیزین را تعیین می کند و ارزیابی اولیه ناخالصی ها را انجام می دهد. برای غربالگری خلوص اولیه عصاره های مواد خام و محصولات خام مناسب است اما نمی تواند به کمیت دقیق دست یابد.
روش عملیاتی اصلی: ابتدا یک صفحه TLC سیلیکاژل قلیایی را با مخلوط کردن سیلیکاژل G با محلول هیدروکسید سدیم در یک خمیر آماده کنید. آن را به طور یکنواخت پخش کنید، آن را در دمای 105 درجه به مدت یک ساعت فعال کنید و اجازه دهید برای استفاده خنک شود. سپس، نمونه مورد آزمایش و استاندارد مرجع سیتیزین را در متانول حل کنید تا محلولهای آزمایشی و محلولهای مرجع در غلظتهای مناسب آماده شوند، سپس آنها را روی صفحه TLC مشخص کنید. از یک سیستم حلال بنزن-استون-اتیل استات-متانول (4:2:1:1) به عنوان عامل توسعه استفاده کنید و اجازه دهید قسمت جلویی حلال به ارتفاع از پیش تعیین شده صعود کند. در نهایت، صفحه را بردارید، بگذارید در هوا خشک شود، و برای تجسم، با یک معرف دراگندورف اصلاح شده (بیسموت یدید پتاسیم) اسپری کنید.
تفسیر نتیجه: پس از تجسم، موقعیت و وضوح لکه ها را مشاهده کنید. یک نمونه سازگار، نقطهای را با رنگ یکنواخت و بدون لکههای خارجی قابل توجه نشان میدهد، با مقدار Rf مطابق با استاندارد مرجع (مقدار Rf استاندارد صنعت- تقریباً 0.23 است). ظهور لکه های خارجی، باطله، یا انحراف قابل توجه در مقدار Rf نشان دهنده محتوای ناخالصی بالا و عدم رعایت استانداردهای خلوص است. این روش دارای محدودیتهای قابل توجهی است: فقط تجزیه و تحلیل کیفی یا نیمه کمی- ارائه میکند، نمیتواند مقادیر خلوص خاص را دقیقاً تعیین کند، و نتایج بسیار نادرستی را برای نمونههایی با سطوح ناخالصی بالا به دست میدهد.
II. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC): روش کمی استاندارد صنعت- مناسب برای محصولات نهایی صنعتی
HPLC در حال حاضر روش استاندارد برای آزمایش خلوص-مواد خام صنعتی و تجاری سیتیزین است. دقت و تکرارپذیری بالایی را ارائه می دهد و امکان تعیین دقیق مقادیر خلوص خاص را فراهم می کند. این برای محصولات تصفیه شده با خلوص بیش از 90٪ مناسب است و به عنوان روش اصلی برای کنترل کیفیت شرکت و تست بازار شخص ثالث عمل می کند.
شرایط استاندارد کروماتوگرافی صنعتی: یک ستون C18 (250 میلی متر × 4.6 میلی متر، 5 میکرومتر) استفاده می شود. فاز متحرک شامل یک سیستم متشکل از 0.05 مول در لیتر محلول سدیم دی هیدروژن فسفات، متانول و پرکلرات آمونیوم (15 میلیلیتر: 85 میلیلیتر: 0.5 گرم) است. پارامترهای عملیاتی شامل سرعت جریان ثابت 1.0 میلی لیتر در دقیقه، طول موج تشخیص 305 نانومتر، دمای ستون 25 درجه و حجم تزریق 10 میکرولیتر است. در این شرایط، پیک سیتیزین متقارن با وضوح خوب است و به طور موثر ناخالصی های آلکالوئیدی رایج را جدا می کند.
روش آزمایش عملی: ابتدا، نمونه های جامد پیش تیمار{0}}در دمای 105 درجه به مدت 4 ساعت تا وزن ثابت خشک شوند تا تداخل رطوبت از بین برود. پس از توزین دقیق، نمونه از طریق فراصوت در متانول حل شده، به حجم می رسد و از طریق یک غشای آلی 0.45 میکرومتر فیلتر می شود. دوم، آمادهسازی منحنی استاندارد{5} محلولهای استاندارد سیتیزین با غلظتهای مختلف تهیه و تزریق میشوند. یک منحنی استاندارد با مساحت پیک در محور y-و غلظت در محور- ترسیم شده است که خطی بودن خوبی را در محدوده 0.04-1.2 mg/mL نشان میدهد. سوم، تجزیه و تحلیل نمونه{11}}محلول آزمایش تزریق میشود، ناحیه پیک ثبت میشود و محتوای سیتیزین با استفاده از منحنی استاندارد برای تعیین خلوص محصول نهایی محاسبه میشود.
این روش به طور موثری از تداخل ناخالصیهای رایج جلوگیری میکند و نتایج را با کمترین خطا به دست میدهد و تمام الزامات تولید صنعتی، کنترل کیفیت و نمونهبرداری دستهای را برآورده میکند. این به عنوان مبنایی برای آزمایش خلوص محصولات نهایی سیتیزین (خلوص بیشتر یا برابر با 98٪) در سراسر صنعت عمل می کند.
III. کروماتوگرافی مایع{1}}طیفسنجی جرمی پشت سر هم (LC-MS/MS): تجزیه و تحلیل دقیق ردیابی مناسب برای ماتریسهای پیچیده
LC-MS/MS یک روش تشخیص با دقت{{1} بالا است که عمدتاً برای تعیین خلوص و محتوای سیتیزین در نمونههای پیچیده مانند مواد خام گیاهی، آمادهسازیهای بیولوژیکی و ماتریسهای غذایی استفاده میشود. قابلیت جداسازی و تشخیص بسیار بالاتر از HPLC استاندارد برای نمونه های حاوی ناخالصی های پیچیده یا مقادیر کمی از آنالیت را ارائه می دهد. غالباً در تحقیقات علمی، تخصیص ارزش محصولات نهایی-و تأیید اصالت استفاده میشود.
جریان کار اصلی شامل استخراج نمونه با استفاده از استونیتریل اسیدی شده و به دنبال آن خالص سازی از طریق ستون های استخراج فاز جامد (SPE) برای حذف مواد مداخله گر مانند رنگدانه ها، پلی ساکاریدها و آلکالوئیدهای مرتبط است. تشخیص با استفاده از حالت مانیتورینگ واکنش چندگانه (MRM) انجام میشود و تمایز دقیق بین سیتیزین و ناخالصیهای مرتبط ساختاری مشابه را امکانپذیر میسازد. با محدودیت بسیار کم تشخیص، خلوص نمونههای با محتوای سیتیزین پایین را به دقت اندازهگیری میکند و به طور موثر بر حساسیت به تداخل ناخالصی مرتبط با طیفسنجی UV و روشهای تیتراسیون غلبه میکند. با این حال، به دلیل هزینه های بالای تجهیزات و گردش کار آزمایشی پیچیده، این روش برای آزمایش دسته ای معمول در تنظیمات کارخانه نامناسب است.
IV. کالریمتری اسکن تفاضلی (DSC): تخصیص خلوص برای مواد مرجع و تأیید{1}}محصولات با خلوص بالا
DSC روش اصلی برای تخصیص مقادیر خلوص به مواد مرجع تایید شده ملی و استانداردهای مرجع با خلوص بالا (بیشتر یا برابر با 99.5٪) سیتیزین است. خلوص را بر اساس تفاوت در خواص حرارتی تعیین میکند و به طور گسترده برای تأیید خلوص-استانداردهای مرجع بالا و تحقیقات{4}}با درجه خلوص-سیتیزین، که یکی از دقیقترین روشهای تشخیص در صنعت است، استفاده میشود.
این روش نیازی به پیش تصفیه نمونه پیچیده ندارد. محتوای ناخالصی و خلوص را با نظارت بر تغییرات جریان حرارتی در طول فرآیند ذوب نمونه و مقایسه نتایج با ترموگرام استاندارد مرجع، به دقت محاسبه میکند و ثبات و دقت استثنایی را ارائه میدهد. مطابق با استانداردهای ملی برای مواد مرجع تایید شده، مواد مرجع سیتیزین باید قبل از صدور پارامترهای خلوص منطبق، ارزش خلوص را با استفاده از ترکیبی از روشهای HPLC و DSC تعیین کنند.
V. روشهای تشخیص کمکی سنتی (به تدریج در حال حذف شدن، فقط برای مرجع)
جذب اشعه ماوراء بنفش و تیتراسیون اسید-باز معمولاً در گذشته در صنعت برای تعیین خلوص سیتیزین استفاده میشد. در حال حاضر، آنها فقط برای تخمین سریع خلوص در محصولات خام خام{{1} با عیار پایین استفاده می شوند. اسپکتروفتومتری UV محتوا را بر اساس جذب در طول موجهای خاص تعیین میکند، در حالی که تیتراسیون به خنثیسازی اسید- برای تعیین کمیت بستگی دارد. اگرچه هر دو روش برای کار ساده هستند و به حداقل سرمایه گذاری تجهیزات نیاز دارند، اما از اشکالات قابل توجهی رنج می برند: آنها به شدت مستعد تداخل ناخالصی ها مانند سایر آلکالوئیدها، اسیدهای آلی و رنگدانه ها هستند که منجر به خطاهای اندازه گیری قابل توجهی می شود. در نتیجه، آنها فقط برای نمونه های ساده با درجه خلوص بالا و سطوح ناخالصی پایین مناسب هستند. که قادر به برآورده کردن استانداردهای کنترل کیفیت صنعتی و انطباق نیستند، تا حد زیادی توسط HPLC جایگزین شدهاند.
VI. ملاحظات کلیدی برای آزمایش (روش های استاندارد صنعت)
1. نمونه قبل از{1} تیمار: قبل از آزمایش، تمام نمونه های جامد سیتیزین باید به مدت 4 ساعت در دمای 105 درجه خشک شوند تا وزن ثابتی برای حذف رطوبت جذب شده به دست آید. این از رطوبت از رقیق شدن ماده فعال و ایجاد خلوص مصنوعی پایین جلوگیری می کند. آمپول های استاندارد مواد مرجع باید بلافاصله پس از باز شدن استفاده شوند و نمی توان آنها را برای استفاده مجدد دوباره مهر و موم کرد.
2. کنترل ناخالصی: نمونههای مشتق شده از گیاه نیاز به خالصسازی کامل دارند تا پلیساکاریدها، فلاونوئیدها و سایر آلکالوئیدهای باقیمانده حذف شوند، در نتیجه از تداخل ناخالصیها با پیکهای کروماتوگرافی و به خطر انداختن نتایج آزمایش جلوگیری میشود.
3. انتخاب روش: TLC برای غربالگری اولیه محصولات خام استفاده می شود. HPLC برای کنترل کیفیت محصول نهایی صنعتی انتخاب شده است. LC-MS/MS برای نمونههایی با ماتریسهای پیچیده انتخاب میشود. و ترکیبی از HPLC و DSC برای سنجش استانداردهای{2} خلوص بالا استفاده میشود.
خلاصه
یک سیستم صنعتی ردیفی برای آزمایش خلوص سیتیزین ایجاد شده است. HPLC به دلیل دقت، کارایی و مقرون به صرفه بودن به استاندارد اصلی برای تولید صنعتی و تجارت تجاری تبدیل شده است. TLC برای غربالگری اولیه سریع مناسب است، در حالی که LC-MS/MS و DSC به ترتیب الزامات آزمایش با دقت بالا برای نمونههای پیچیده و استانداردهای{5} خلوص بالا را برآورده میکنند. هر روش نقش خاصی را ایفا می کند و در مجموع یک راه حل جامع برای آزمایش خلوص سیتیزین تشکیل می دهد.
Shaanxi Lv Ke Chun Yuan Biotechnology Co., Ltd
آدرس ما
Huaxia Yue World، منطقه Weibin، شهر Baoji، استان Shaanxi
شماره تلفن
+86-13571783771
ایمیل-
